Опыт регистрации изображений в световой микроскопии
Статья написана для тех, кто хочет разобраться в проблеме регистрации изображения, полученного через световой микроскоп, с помощью современных цифровых устройств широкого назначения.
В статье изложены факторы, влияющие на качество получаемых при этом цифровых изображений, и способы, при помощи которых это качество можно улучшить.
Рассмотрены конкретные примеры решения поставленной задачи в различных отраслях науки и техники.
- Введение
Начало 21-ого века отмечено появлениями огромного количества стремительно расширяющихся новых технологий в различных практических приложениях науки и техники. Это касается, в том числе, и микроскопии.
На рынке появился широкий спектр прикладных телевизионных систем, специализированных цифровых камер высокого разрешения, управляемых с помощью персонального компьютера, а также цифровых фотокамер. Уверенный прогресс характеристик и сервисных возможностей, а также заметное снижение цен на ряд изделий этого вида приводит к естественному желанию использовать их в составе световых микроскопов для решения задачи быстрой регистрации изображения препарата, наблюдаемого в окуляры во время исследования. Такая задача ставится пользователями световых микроскопов при наблюдении различных видов препаратов и использовании необходимых в каждом случае методов освещения: в светлом и тёмном поле, в проходящем и отражённом свете, по методу фазового, фазово-темнопольного контраста, люминесценции и др.
Использование системы регистрации, построенной на основе одного из трёх вышеназванных типов, диктуется конечной задачей пользователя, типом объектов исследования и финансовыми возможностями. При выборе следует ответить на вопрос, должна ли такая система работать в реальном времени, т.е. отображать на экране монитора и фиксировать на каком-либо носителе изображение с определённым количеством кадров в секунду.
Говоря далее о таких системах и рассматривая их на примере применения цифровой фотокамеры, будем иметь в виду, что рассуждения, касающиеся качества получаемых изображений, справедливы также и для случаев использования систем на основе двух других типов.
ООО "НПК "Зенит" представляет своим заказчикам результаты применения цифровой фотокамеры в световой микроскопии.
Как и в случае использования классической плёночной фотокамеры, цифровой фотоаппарат устанавливается в фотоканале микроскопа. Такой фотоканал устроен и располагается по-разному, в зависимости от модели микроскопа. Между фотоканалом и цифровым фотоаппаратом располагается специализированный оптико-механический адаптер, обеспечивая нужные режимы и условия работы фотоаппарата.
Сказанное означает, что круглое поле зрения микроскопа описано вокруг прямоугольного поля зрения присоединённого фотоаппарата. При этом достигается условие совпадения центра окулярного поля зрения, и центральной части кадра. Это прямоугольное поле в процессе работы может становиться меньше визуального поля в окулярах в том случае, если фотоаппарат имеет собственную смену увеличения.
Кроме этого, обеспечивается условие, при котором объект, наблюдаемый с наилучшим качеством в окулярах правильно настроенного микроскопа, выглядит на фотоснимке также с наилучшим возможным качеством.
Последняя фраза требует некоторого разъяснения.
Существует целый ряд важных факторов, влияющих на итоговое качество изображения применительно к микрофотографии и не только к ней. Для решения задачи, связанной с получением качественного цифрового снимка через микроскоп, кратко рассмотрим каждый из них.
- Теоретические ограничения
- Историческая ситуация
- Факторы, связанные с правильной эксплуатацией микроскопа
- Практические особенности решения проблемы
- Изображение на экране монитора
- Особенности, связанные с фотокамерой
- Заключение
- Примеры
Не вдаваясь глубоко в теорию, напомним, что наука о микроскопии и расчёт всех компонентов светового микроскопа исторически изначально включали в себя понятие теоретической разрешающей способности основного приёмника изображения, с которым работает микроскоп, а именно, глаза человека. Известно, что она составляет величину, примерно равную одной угловой минуте. Именно этот параметр является краеугольным в понятии полезного увеличения микроскопа. Это понятие базируется на расчётах, учитывающих волновую природу света и, как следствие этого, явление дифракции, возникающее на краях присутствующих в микроскопе материальных диафрагм.
В алгоритме синтеза, расчёта и оптимизации сквозной оптической схемы микроскопа предусматривается та степень суммарной коррекции величин всех остаточных расчётных аберраций, которая связана с пределом разрешения глаза. Другими словами, величину этих аберраций при расчёте стараются подогнать до тех значений, при которых они будут заметны для глаза при наблюдении в окуляр микроскопа в минимальной степени. Совокупностью величин остаточных аберраций в центре и по полю изображения характеризуется качество расчёта и изготовления микроскопа.
На протяжении истории развития микроскопии теория расчёта микрооптики не стояла на месте. Качество микроскопа, выпущенного в середине истекшего века, второй его половине и в начале нынешнего – это три различные фазы состояния науки о микроскопе и, соответственно, принципиально отдельные по характеристикам классы приборов, качество и возможности которых сильно отличаются между собой. Такие отличия мы найдём по степени коррекции монохроматических расчётных аберраций в центре, средней части и на краю поля, а также по ширине самого поля, по степени остаточной хроматической разности увеличений, по величине вторичного спектра в изображении, качеству методов освещения, контрастирования и т. д.
В практике синтеза и расчёта схем микроскопов ранее часто использовался приём, при котором за итоговую коррекцию качества изображения отвечал не только микрообъектив, но и окуляр, который брал на себя исправление значительной части остаточных аберраций, в частности, хроматизма, если его не удалось исправить в процессе оптимизации схемы микрообъектива.
Таких семейств микрообъективов с различной степенью коррекции аберраций за историю развития микроскопии сформировалось несколько. Под каждое из таких семейств были рассчитаны и изготовлены соответствующие комплекты окуляров с обратным знаком коррекции хроматизма.
Тогда, строго говоря, при использовании различных семейств микрообъективов для целей микрофотографии, следовало бы под каждое из них создать свой оптико-механический адаптер, который в фотоканале взял бы на себя докомпенсацию имеющихся в микрообъективе остаточных аберраций.
Учитывая наличие в мире нескольких ведущих фирм-производителей, каждая из которых создавала свои микроскопы по собственным методикам расчёта и связанное с этим большое количество групп объективов, с различной коррекцией, не представляется целесообразным создание под каждую из них соответствующего оптико-механического адаптера для микрофотографии.
Если фотокамера применяется в микроскопе с микрообъективами, имеющими значительный краевой расчётный хроматизм, который может достигать двух и более процентов на краю поля зрения, то качество снимка, полученное с использованием таких объективов, будет заметно отличаться в худшую сторону. То же самое можно отнести к использованию объективов с недоисправленной кривизной поля, комой и астигматизмом. При рассматривании снимков, полученных такими объективами, мы не увидим одинаковой резкости по всему полю.
Качество изображения в микроскопе в очень большой мере зависит от физического состояния всех его оптических компонентов, качества их сборки, чистоты оптических поверхностей, качества просветляющих покрытий, правильной настройки освещения.
Перед фотографированием и даже просто перед началом изучения какого-либо интересующего нас препарата необходимо тщательнейшим образом провести правильную настройку системы освещения (см. инструкцию по эксплуатации микроскопа или соответствующую справочную литературу по микроскопии).
Необходимо также убедиться в чистоте микрообъектива, окуляров и других оптических элементов микроскопа, микрофотонасадки, оптико-механического адаптера, объектива фотоаппарата, ибо всё это влияет в конечном счёте на контраст изображения, количество рассеянного света и наличие артефактов в поле зрения.
Особое внимание следует обратить на то, правильно ли подготовлен препарат. О важности этого фактора часто забывают (или ничего не могут с этим сделать). Дело в том, что показатели преломления предметного и покровного стёкол, применяемых при изготовлении препарата, а также их толщины заложены в оптическую схему микроскопа на этапе её расчёта. Поэтому отступление названных параметров от расчётных значений на величину, превышающую разрешённый допуск, неминуемо влечёт за собой нарастание сферической аберрации и ухудшение качества изображения при использовании объективов средних и высоких числовых апертур.
Показатель преломления иммерсионного масла при использовании соответствующего объектива тоже входит в оптический расчёт, поэтому при наблюдении с иммерсией необходимо применять только то масло, которое указано в руководстве к микроскопу. Масла-суррогаты использовать нельзя.
Необходимо помнить о том, что для работы с препаратами, содержащими покровное стекло и в которых оно не используется, должны применяться различные типы микрообъективов.
Важным является также и то, что если микрообъектив рассчитан на «бесконечную» длину тубуса, то это условие тоже обязательно должно соблюдаться. В противном случае цена всегда одна и та же – неминуемое ухудшение качества изображения из-за возникающих аберраций, вызванных нарушением расчётной оптической схемы.
При решении поставленной задачи фотосъёмки через микроскоп весьма распространённой является следующая ситуация.
Имеется микроскоп, в котором отсутствует фотоканал. Для установки на такой микроскоп фотокамеры, необходимо применить микрофотонасадку. Идеальной для этой цели является насадка, специально рассчитанная для имеющегося микроскопа и штатно входящая в его комплект принадлежностей.
Качество фотоснимков было бы самым высоким, если бы все оптические компоненты «стояли бы на своём месте». К этому числу относится и фотоканал с объективом цифровой фотокамеры, который вместе с остальными элементами входит в общую схему микроскопа. Такую схему следовало бы просчитать «насквозь» от плоскости препарата до плоскости ПЗС-матрицы цифровой фотокамеры с учётом её разрешающей способности.
К сожалению, на практике этот идеальный вариант встречается далеко не всегда и поэтому приходится идти на компромиссы, связанные с применением доступных в данный момент на рынке микрофотонасадок и постоянно обновляющимся парком цифровых фотокамер.
Например, прежде на ЛОМО выпускался исследовательский микроскоп «БИОЛАМ-И». В его комплект входила микрофотонасадка МФН-11, рассчитанная на соответствующий набор входивших в этот микроскоп объективов с линейным полем 18 мм и длиной тубуса 160 мм. Насадка содержала в своей конструкции магазин с тремя сменными компонентами для изменения увеличения. Фототубус этой насадки работал с гомалью для построения изображения в кадровом окне 35-мм фотокамеры.
Микроскописты в своей практике нередко вынуждены были приобретать эту или другую имевшуюся на рынке насадку и, с одной стороны, эксплуатировать её в нештатной для неё схеме, а с другой, вообще применять насадку на «чужом» для неё микроскопе. Сверху, вместо штатного фототубуса устанавливался оптико-механический адаптер, с которым соединялась цифровая фотокамера.
Иногда пользователь не хочет или не может приобрести микрофотонасадку, но желание применить цифровую фотокамеру его не покидает. Он очень просит «посадить его фотокамеру на окуляр». Такое решение является по многим причинам нецелесообразным. Безусловно, это очень не эргономично, ибо сразу пропадает возможность бинокулярного наблюдения объекта, создаются проблемы и при съёмке, и при визуальных наблюдениях, фотокамера консольно «свисает» перед лицом оператора, создавая изламывающую нагрузку на штатив микроскопа.
Однако просьбы заказчиков были удовлетворены, и специально для них ООО "НПК "Зенит" разработала так называемый адаптер визуального канала, который устанавливается вместо окуляра в один из тубусов бинокулярной насадки. К выходу адаптера крепится цифровая фотокамера. Такой адаптер, соединённый с фотокамерой, обеспечивает высокое качество изображения, соответствующее круглому полю зрения микроскопа, описанному вокруг прямоугольного поля зрения фотоаппарата.
Конечно, на рабочих местах пользователей продолжает оставаться огромное количество морально и физически устаревших моделей микроскопов. Они по-разному эксплуатируются, хранятся и обслуживаются, поэтому оценка их работоспособности требует внимательного подхода, особенно если стоит задача получения с их помощью качественных микрофотографий.
Если есть возможность, то лучше пригласить эксперта, который мог бы при необходимости произвести сервисное обслуживание микроскопа, провести его аттестацию качества и обучить персонал необходимым навыкам работы.
В ряде случаев удаётся найти возможность модернизации оптической схемы и выведения морально и физически устаревшего микроскопа на качественно новый уровень при сохранении многих его базовых модулей.
После получения фотоснимка своего препарата, и передаче его в компьютер, пользователь может рассматривать его на мониторе с различной степенью увеличения. При рассматривании выбранного сюжетно важного фрагмента возникает по-житейски вполне понятный соблазн укрупнить изображение на экране, благо для этого требуется всего лишь щелчок мышью. Значение же при этом итогового увеличения изображения препарата, наблюдаемого на мониторе, может в десятки, и даже сотни раз превысить пределы полезного увеличения, о которых говорилось выше. Всё зависит от «количества щелчков мышью» и размеров экрана монитора. Вследствие этого на контурах изображений объектов появляются ярко выраженные нерезкость и цветные окантовки, обусловленные наличием остаточных аберраций элементов оптической системы микроскопа, и, прежде всего, микрообъектива.
При наблюдении в окуляр, угловой размер этого же участка препарата был, естественно, гораздо меньше, следовательно, во столько же раз в меньшей степени были заметны все огрехи изображения (аберрации оптической системы). Всё это означает, что рассматривание изображения препарата на экране «покрупнее» приводит только к увеличению масштаба, но не добавляет количество новых деталей в нём. Поэтому, чтобы не видеть проявления расчётных аберраций оптической системы микроскопа на экране монитора, строго говоря, мы должны выставить масштаб увеличения на экране таким, при котором обеспечивается равенство углов полей зрения, под которым мы наблюдаем тот или иной фрагмент препарата, глядя на экран, и в окуляры микроскопа.
Другой аспект качества микрофотографии связан с конечным звеном – самой фотокамерой.
Когда мы говорим о регистрации каких-либо изображений, необходимо помнить о различном восприятии одного и того же изображения человеческим органом зрения и фотокамерой с электронным фотоприёмником, которым является ПЗС-матрица. Здесь есть несколько факторов.
Это, во-первых, разрешающая способность, которая у глаза намного выше, а также протяжённость линейного динамического диапазона, т.е. способность одномоментно, достоверно, без искажений и шумов отображать яркие и тёмные детали изображения. Этот параметр у глаза также намного шире.
Кроме этого, человеческий орган зрения - это анализатор, использующий сложнейшие внутренние и далеко не полностью изученные алгоритмы обработки, позволяющий при наблюдении объекта извлекать полезную информацию, как при наличии сильных помех, так и в сложных условиях освещения. Совокупностью таких свойств пока не обладают НИКАКИЕ из искусственно созданных приёмников изображения.
Нельзя забывать о том, что объектив цифровой камеры также оказывает влияние на качество изображения равно как и её собственные алгоритмы сжатия и обработки записанных в память изображений.
Этим и объясняется то, что опытный эксперт часто, если не всегда, вынесет окончательное заключение, что изображение в окулярах микроскопа он видит с бОльшими подробностями, чётче и контрастнее, чем при наблюдении с помощью любой, самой «многопиксельной» камеры.
Все без исключения перечисленные факторы являются очень важными и вносят каждый свой вклад в итоговое качество изображения, и поэтому их обязательно необходимо учитывать, когда мы говорим о качестве микрофотографии.
Подробную методику цифровой микрофотографии пользователь получает от ООО "НПК "Зенит" в виде отдельного документа вместе с комплектом приобретаемого оборудования и программного обеспечения для получения, обработки, измерения и архивации полученных изображений.
ООО "НПК "Зенит" обращает внимание своих заказчиков на то, что ряд адаптеров, предлагаемых сегодня на рынке, позволяют фотографировать не всё поле изображения, наблюдаемого в окуляры микроскопа, а только его центральную часть с затемнением по краю. Перед покупкой такого устройства необходимо обратить на это особое внимание!
В общем случае, для улучшения качества получаемых микрофотографий, по возможности, следует стараться придерживаться использования микроскопов, в комплекте которых применяется современное поколение микрообъективов класса широкопольных планапохроматов с длиной тубуса «бесконечность». Такие объективы обладают наивысшей возможной степенью коррекции всего набора полевых расчётных аберраций для видимой области спектра без использования дополнительных компенсационных схем.
Именно для такого семейства объективов ООО "НПК "Зенит" и были спроектированы специализированные оптико-механические адаптеры для целей микрофотографии, устанавливаемые в фотоканал. Такие адаптеры были также спроектированы для различного рода прикладных телевизионных систем и специализированных цифровых камер.
Далее представлены несколько вариантов конкретных схемных решений.
К сказанному остаётся добавить, что для широкого круга задач, встречающихся в световой микроскопии в различных аспектах медицины, промышленности и техники, были созданы специализированные программные продукты для обработки, измерения и архивации полученных результатов. С перечнем и кратким описанием возможностей этого программного обеспечения можно ознакомиться здесь.
На следующем снимке микроскоп «ЛАБОМЕД-4» с адаптером и цифровой фотокамерой «NIKON COOLPIX 4500».
На снимках ниже представлены различные модификации адаптеров визуального канала для микроскопов различных фирм ЛОМО, Leica, ZEISS.
Аналогичный случай установки специализированной ТВ-камеры ООО " НПК "Зенит" в фотоканале стереомикроскопа фирмы ZEISS «Stemi 2000C»для оценки качества и дефектоскопии высокоточных подшипников.
Ниже представлены изображения участков интегральной микросхемы, полученные через металлографический микроскоп МЕТАМ ЛВ-32 производства ЛОМО с помощью адаптера производимого ООО "НПК "Зенит" и цифровой фотокамеры.
Результат применения цифровой фотокамеры в схеме микротвердомера ПМТ-3 производства ЛОМО. Модернизированная схема прибора была предложена ООО "НПК "Зенит". При этом в несколько раз улучшилась точность измерения числа твёрдости, и улучшилось качество изображения отпечатка алмазной пирамиды. Приведены два сильно уменьшенных снимка одного и того же отпечатка в светлом и тёмном поле.
Случай применения ТВ-камеры и специализированного оптико-механического адаптера в составе с микроинтерферометром МИИ-4 производства ЛОМО для измерения микрорельефа поверхностей. В схеме может быть также использована цифровая фотокамера.
Здесь приведён общий вид цифровой системы регистрации (ЦСР) изображения на основе камеры высокого разрешения.
__________________________________________________________________
Аннотация